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WB實(shí)驗(yàn)代測,Western Blot技術(shù)服務(wù),免疫印跡代測
  • 產(chǎn)品型號:
  • 廠商性質(zhì):經(jīng)銷商
  • 更新時間:2015-09-10
  • 訪  問  量:2906
簡要描述:

上海信帆生物代做Western Blot實(shí)驗(yàn),提供技術(shù)指導(dǎo),提供售后服務(wù),歡迎!WB實(shí)驗(yàn)代測,Western Blot技術(shù)服務(wù),免疫印跡代測

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聯(lián)系電話:025-66060117

產(chǎn)品詳情

本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn),不得用于醫(yī)療或食用

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting),它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù),可用于定性和定量分析。這一技術(shù)zui初用于研究DNA 結(jié)合蛋白,目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
Western blot 檢測1000元/膜每張膜1--8樣本,一抗另計(jì)
EMSA  2800元/膜 每張膜1--8樣本,包括探針及試劑


WB實(shí)驗(yàn)代測,Western Blot技術(shù)服務(wù),免疫印跡代測
上海信帆代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目:ELISA,免疫組化,免疫印跡Western Blot,放射免疫,實(shí)時熒光定量PCR,特殊染色,病理學(xué)檢測技術(shù)服務(wù)等等!我們擁有的實(shí)驗(yàn)室,客戶檢測項(xiàng)目均提供實(shí)驗(yàn)室儀器型號,提供操作詳細(xì)步驟.歡迎!
Western Blot實(shí)驗(yàn)
成功完成Western Blot檢測,必須滿足4個條件:

凝膠洗脫:轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來,如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中,將無法在膜上進(jìn)行分析

吸附到膜上:在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上,如果蛋白不吸附,將無法在膜上進(jìn)行分析

處理期間仍截留在膜上:在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上

處理過程中可接近:被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸,如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測

成功進(jìn)行WB檢測,則設(shè)置合適正確的對照是*的,只要正確設(shè)置了這些對照,即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在,并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性!一般需要設(shè)置的對照如下:

陽性對照:明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞,用于檢測抗體的工作效率

陰性對照:明確不表達(dá)檢測蛋白組織或細(xì)胞,用于檢測抗體的特異性

二抗對照:不加一抗,用于檢測二抗的特異性

內(nèi)參對照:檢測標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)

空白對照:不加一抗和二抗;用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果 

WB實(shí)驗(yàn)代測,Western Blot技術(shù)服務(wù),免疫印跡代測

WB 檢測基本過程 

1 、獲取細(xì)胞或組織裂解物 

1)根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer:

蛋白位置 

推薦buffer

全細(xì)胞

NP-40 or RIPA

胞漿(可溶性蛋白)

Tris-HCl

胞漿(骨架結(jié)合蛋白)

Tris-Triton

膜蛋白

NP-40 or RIPA

核蛋白

RIPA or 核蛋白提取試劑盒

線粒體蛋白

RIPA or 線粒體分離試劑盒

亦可購買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標(biāo)本制備的質(zhì)量

2)選擇合適的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測的準(zhǔn)確性!

2 、蛋白定量 

常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用,進(jìn)行免疫沉淀(IP)或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白

3 、電泳分離蛋白質(zhì) 

根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件: 

待測蛋白狀態(tài)

凝膠條件

上樣buffer

電泳buffer

Reduced - Denatured

還原,變性

含β-巰基乙醇或DTT,含SDS

含SDS

Reduced - Native

還原,不變性

含β-巰基乙醇或DTT,不含SDS

不含SDS

Oxidized - Denatured

不還原,變性

不含β-巰基乙醇或DTT,含SDS

含SDS

Oxidized - Native

不還原,不變性

不含β-巰基乙醇或DTT,不含SDS

不含SDS

根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度

蛋白分子量(kDa)

凝膠濃度(%)

4-40

20

12-45

15

10-70

12.5

15-100

10

25-200

8

4 、轉(zhuǎn)膜 

根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜(NC膜)和尼龍膜,其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下:

 

PVDF膜

NC膜

尼龍膜

靈敏度和分辨率







背景





較高

蛋白結(jié)合能力

100-200ug/cm2(適用于SDS存在時與蛋白結(jié)合)

80-100ug/cm2

>400ug/cm2

機(jī)械強(qiáng)度

強(qiáng)

干的膜易脆

軟而結(jié)實(shí)

溶劑抗性

強(qiáng)





使用前是否需要浸潤

100%甲醛潤濕

緩沖液潤濕

緩沖液潤濕

適用染色方法

膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭

膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁

不能用陰離子染料

適用檢測方法

顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測

顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性

顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性

適用范圍

普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質(zhì)測序、氨基酸分析、重復(fù)檢測

普通蛋白WB、氨基酸分析、重復(fù)檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白

低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用

價格



較低



5 、封閉 

去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn),降低背景。常用的封閉溶液有:含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育 

一抗的選擇成功與否,是整個WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵:選擇一抗有以下幾個注意點(diǎn):

選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗(說明書有驗(yàn)證)

選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗(說明書有驗(yàn)證)

選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體

一抗的保存和使用:

根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存;一般需要將抗體分裝后放入-20度保存,避免反復(fù)凍融。

抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,在4度保存不要超過2周

根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測方法等的差異,說明書推薦的稀釋比例只作參考,需要在說明書推薦的濃度周邊進(jìn)行多個濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測,然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說明書沒有推薦濃度,可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度(1:100-1:3000)。

孵育條件:推薦4°C孵育過夜(一般大于18個小時),根據(jù)抗體親和力不同孵育時間有所區(qū)別

內(nèi)參的選擇和使用:WB 過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)! 

WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù):

內(nèi)參名稱

分子量大小

適用范圍

beta-actin

43kDa

胞漿和全細(xì)胞

GAPDH

30-40kDa

胞漿和全細(xì)胞

Tubulin

55kDa

胞漿和全細(xì)胞

VCDA1/Porin

31kDa

線粒體

COXIV

16kDa

線粒體

TBP

38kDa

細(xì)胞核

詳情請參考

7 、二抗孵育 

根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度,可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度(1:1000-1:20000)。孵育條件一般為室溫1-2小時

8 、底物孵育 

選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光,靈敏度高且背景低,節(jié)省抗體用量

9 、結(jié)果分析和檢測 

凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片

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