NI-NTA瓊脂糖凝膠6FF緩沖液制備
金屬螯合親和層析介質(zhì)，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，F(xiàn)e3+發(fā)生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)，從而達到分離純化的目的。因此，偶聯(lián)這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。一般來說，Ni2+是用于純化組氨酸標記的蛋白質(zhì)的優(yōu)選金屬離子。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結(jié)合，但這種結(jié)合力要遠小于組氨酸殘基與金屬離子的結(jié)合力。鎳親和層析介質(zhì)具有特異性好、流速快的優(yōu)點，非常適合放大生物試劑。
Ni NTA瓊脂糖凝膠6FF預(yù)先偶聯(lián)Ni2+離子。通常，Ni2+是用于純化重組組氨酸標簽蛋白的優(yōu)選金屬離子，用咪唑進行洗脫。我們建議在含0.5-1.0 M NaCl的緩沖液，中性至弱堿性pH 7-8，這樣的條件下結(jié)合，經(jīng)常使用磷酸鈉緩沖液。也可以使用Tris-HCl，但是在金屬-蛋白質(zhì)親和力非常弱的情況下應(yīng)該避免，因為它可以降低結(jié)合強度，在緩沖液中避免螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽的存在。如果重組組氨酸標簽蛋白表達為包涵體，則在所有緩沖液中包括高達6M Gua-HCl或8M尿素。當使用
高濃度的尿素或Gua-HCl時，通常發(fā)生蛋白質(zhì)解折疊。包涵體變性復(fù)性是個很復(fù)雜的過程，一般的建議純化可溶蛋白。
提示：含有尿素的樣品可以通過SDS-PAGE直接分析，而含有Gua-HCl的樣品在SDS-PAGE之必須用尿素緩沖液置換緩沖液。
緩沖液制備
用于緩沖液制備的水和化學(xué)品應(yīng)具有高純度。使用通過0.45μm過濾器過濾緩沖液。 使用高純度咪唑，因為這將在280nm處產(chǎn)生非常低的吸光度或沒有吸光度。
推薦緩沖液
結(jié)合緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，pH 7.4（佳咪唑濃度是依蛋白質(zhì)性質(zhì)而定的，20-40mM適用于許多蛋白質(zhì)）。洗脫緩沖液：20mM 磷酸鈉，0.5M NaCl，500mM 咪唑，pH 7.4（洗脫所需的咪唑濃度是依蛋白質(zhì)性質(zhì)而定的）。
注意事項：
1.上樣之，樣品必須經(jīng)過膜過濾及去除色素，否則雜質(zhì)及色素會被吸附到填料上，影響填料的正常使用。
2.在使用過程中，避免使用高濃度的強酸強堿，酸和堿的濃度應(yīng)低于 0.1 摩爾。堿會使流速變慢。
3.不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據(jù)相關(guān)的文獻進行。
更新時間：2021-10-20 
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