單克隆抗體的制備全過程

原理：

B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對(duì)這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細(xì)胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無限生長(zhǎng)的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。

過程

1）免疫脾細(xì)胞的制備 制備單克隆抗體的動(dòng)物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內(nèi)直接免疫法。
2）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選 在融合前，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過含8-AG的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT的活性（恢復(fù)HGPRT的活性的細(xì)胞不能在含8-AG的培養(yǎng)基中存活）。骨髓瘤細(xì)胞用10%小牛血清的培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
3）細(xì)胞融合的關(guān)鍵:
1技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。
2融合試驗(yàn)較大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術(shù)。

4）陽(yáng)性克隆的篩選 應(yīng)盡早進(jìn)行。通常在融合后10天作第一次檢測(cè)，過早容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。檢測(cè)方法應(yīng)靈敏、準(zhǔn)確、而且簡(jiǎn)便快速。具體應(yīng)用的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)，以及所需單克隆抗體的功能進(jìn)行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法簡(jiǎn)便，RIA法準(zhǔn)確。陽(yáng)性克隆的篩選應(yīng)進(jìn)行多次，均陽(yáng)性時(shí)才確定為陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增。
5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體。克隆化應(yīng)盡早進(jìn)行并反復(fù)篩選。這是因?yàn)槌跗诘碾s交瘤細(xì)胞是不穩(wěn)定的，有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株?？寺』姆椒ê芏?，而常用的是有限稀釋法。

（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細(xì)胞，然后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。這種方法操作復(fù)雜，效率低，故不常用。
（2）有限稀釋法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞增值后成為單克隆細(xì)胞系。第一次克隆化時(shí)加一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞。由于第一次克隆化生長(zhǎng)的細(xì)胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株需經(jīng)2～3次的再克隆才成。應(yīng)該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細(xì)胞都應(yīng)冷凍保存，以便重復(fù)檢查，避免丟失有意義的細(xì)胞。
（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細(xì)胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細(xì)胞不能自由移動(dòng)，彼此互不相混，從而達(dá)到單細(xì)胞培養(yǎng)的目的。但此法不如有限稀釋法好。
（4）熒光激光細(xì)胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標(biāo)記雜交瘤細(xì)胞，然后根據(jù)抗原與雜交瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性選出細(xì)胞，并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。

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（5）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
（6）大規(guī)模單克隆抗體的制備 選出的陽(yáng)性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時(shí)甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。

單克隆抗體的制備全過程