BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒樣本準(zhǔn)備要求

描述：BrdU檢測試劑盒用于細(xì)胞和組織切片的細(xì)胞增殖檢測。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine)，即5-溴脫氧尿嘧-啶核苷，是胸腺嘧啶核苷(T)類似物，檢測原理為BrdU可以通過競爭替代胸腺嘧啶核苷T摻入DNA合成期(S期)。當(dāng)處于旺盛分裂的細(xì)胞摻入BrdU后，利用抗BrdU抗體和抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng)，即可檢測出含有BrdU的細(xì)胞，結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行雙重標(biāo)記，可判斷出增殖細(xì)胞的種類、增殖速度等，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。BrdU經(jīng)活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)進(jìn)入組織細(xì)胞，摻入DNA定位準(zhǔn)確，可有效反應(yīng)S期細(xì)胞新合

成DNA的水平，而且受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境影響小，標(biāo)記不會(huì)丟失。

細(xì)胞樣品：

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：提前準(zhǔn)備細(xì)胞爬片，確保細(xì)胞狀態(tài)正常，貼壁良好；

2. BrdU孵育：細(xì)胞經(jīng)含BrdU的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中避光孵育一定時(shí)間，BrdU濃度及細(xì)胞孵育時(shí)間依據(jù)細(xì)胞種類不同，建議預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳條件。注意事項(xiàng)中已測試細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件可供參考；

3. 細(xì)胞固定：上述經(jīng)BrdU孵育的細(xì)胞爬片，PBS洗3次，每次5min。向孔板內(nèi)加入1mL 4%多聚甲醛覆蓋細(xì)胞，室溫固定20-30min。PBS洗3次，每次5min；

4. 通透：向孔板內(nèi)滴加破膜液覆蓋細(xì)胞處理8-10min，PBS洗3次，每次5min；

5. 細(xì)胞核染色（可選）：

若后續(xù)白光檢測，則用蘇木素染細(xì)胞核：向孔板內(nèi)滴加蘇木素染液室溫染色5min，吸棄蘇木素染液，PBS洗3次，每次5min；

若后續(xù)熒光檢測，則用DAPI染細(xì)胞核：向孔板內(nèi)滴加DAPI染液室溫染色5min，吸棄DAPI染液，PBS洗3次，每次5min；

6. 再固定：向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min；

7. 酸化：向孔板內(nèi)滴加1M HCl覆蓋細(xì)胞，37℃處理10min，PBS洗3次，每次5min；

8. 后固定：再次向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min；

9. 封閉：向孔板內(nèi)滴加封閉液（3% BSA）室溫孵育30min。吸棄封閉液，不要清洗；

10. Anti-BrdU抗體孵育：向孔板內(nèi)滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋細(xì)胞，4℃孵育過夜。吸棄anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5min；

11. 二抗孵育：向孔板內(nèi)滴加二抗工作液覆蓋細(xì)胞，室溫孵育1h。吸棄二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標(biāo)記的二抗，孵育及洗滌時(shí)均需避光；

結(jié)果觀察

如果用HRP標(biāo)記的二抗檢測，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，增殖細(xì)胞呈棕色。如果是熒光標(biāo)記的二抗，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（Ex=358 nm，Em=461 nm），增殖細(xì)胞為對(duì)應(yīng)二抗的熒光。

注意事項(xiàng)

1. 對(duì)于細(xì)胞爬片樣品，BrdU的使用濃度和處理時(shí)間與細(xì)胞種類有關(guān)。一般來說，處理腫瘤細(xì)胞所需濃度和時(shí)間都較低，成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞等增殖較慢的細(xì)胞需要提高濃度并延長作用時(shí)間，建議濃度范圍為20-100μM，作用時(shí)間為40min-4h，可根據(jù)具體細(xì)胞的種類進(jìn)行摸索調(diào)整。

下表為測試的常用細(xì)胞處理濃度及時(shí)間，僅供參考。