并不是所有的實(shí)驗(yàn)都可以做real－time的，技術(shù)路線要選好。當(dāng)你的基因表達(dá)量少或有些不表達(dá)。具體就是做普通pcr跑膠條帶比較弱，不是很亮的情況下，個(gè)人覺得不要選擇real，不容易做好，特別是融解曲線。用sbgr green染料做的話，引物設(shè)計(jì)時(shí)擴(kuò)增片斷小于250bp，太長了不好擴(kuò)。預(yù)實(shí)驗(yàn)先rt－pcr，梯度溫度擴(kuò)增，尋求退火溫度。并確定有較亮的目的條帶，試劑盒不能太差，要省錢的話可以把體系降到20ul，不要用普通的pcr試劑盒＋sbgr green來作real，可以做出來，但是不穩(wěn)定，很耗時(shí)間精力。上下游引物可以混在一起，摸條件時(shí)加樣比較方便，如果要批量的話，是分開的好些。如果用的是普通pcr的ep管，可以把蓋子剪掉，再加入20ul的石蠟油或礦物油封住液面，效果比較好，當(dāng)然要確定你的機(jī)子是從蓋子上面檢測(cè)熒光的，而不是從側(cè)管壁。融解曲線不好，特別是有目的條帶高峰，但前面65－75度峰也較高時(shí)，可以再做一次融解曲線，一般都會(huì)變好一點(diǎn)，不過是把條件優(yōu)化。

Real比較敏感，融解曲線不太好的時(shí)候，電泳結(jié)果也可以，所以對(duì)引物設(shè)計(jì)要求高些。如果條件優(yōu)化很多次都好不了，那就換個(gè)引物了

提取步驟：invitrogen的RNA提取試劑盒trizol，紅色，100ml
1，取組織50－100mg，加入trizol試劑1ml，剪碎組織塊，勻漿5－15分鐘，后放室溫裂解5分鐘
2，4度，12000rpm離心10分鐘，換新ep管，取上清
3，按200ul/ml的trizol加入氯仿（1/5的體積），手動(dòng)劇烈振蕩15秒，后室溫放置3分鐘
4，4度，12000rpm離心15分鐘
5，取上清至新ep管，注意少震動(dòng)，少吸，一般400ul，不能吸入中間絮狀物質(zhì)
6，按500ul/ml的trizol（等體積的，那就是400ul）的加入異丙醇（預(yù)冷），室溫10分鐘
7，4度，12000rpm離心10分鐘，棄上清，應(yīng)該可以見到白色沉淀
8，加入75%的乙醇1ml洗滌，懸浮沉淀
9，4度，7500rpm離心5分鐘
10， 去上清，風(fēng)干，5分鐘左右
11， 加入DEPC處理過的無酶水20－40ul，吹打融解沉淀，－70度保存
如果不是提特殊組織（如胰腺），好像也不是很難提，RNA也不是那么容易降解的。
我們經(jīng)?？谡置弊佣疾淮?，也沒事。但是關(guān)鍵步驟一定要注意，小心。
組織要?jiǎng)驖{好，可以把組織剪碎，剪刀我們也沒處理，盡快吧，加入trizol以后就沒事了，它可以抑制RNA降解的。一般就4－5分鐘，組織塊成白色的就行了。室溫裂解可以多放幾分鐘。
第5步比較關(guān)鍵，中間層一定不要吸。操作要輕柔，防止中間層飄起。
第7步就可以看見沉淀了，沉淀多，后面的水就多加些（40ul），如果沒看見沉淀，加水10ul就可以了，有些是有的，只是量太少了看不見。
提RNA一次提完，也就3個(gè)小時(shí)左右，不要提一半后保存
提完后測(cè)個(gè)濃度盡快逆轉(zhuǎn)錄